哺乳動(dòng)物細胞培養指南
什么是細胞培養？
細胞培養是指將細胞從動(dòng)物或植物體內取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長(cháng)的過(guò)程。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過(guò)酶或機械方法進(jìn)行解離，也可以來(lái)源于已建立的細胞系或細胞株。
原代培養
原代培養的過(guò)程指動(dòng)物的組織或器官從機體取出后，經(jīng)機械法或各種酶類(lèi)（常用胰蛋白酶）和鰲合劑（常用EDTA)處理，使之分散成單個(gè)細胞，加入適量培養基，置于合適的培養容器中，在無(wú)菌、適當溫度和一定條件下，使之生存、生長(cháng)和繁殖的過(guò)程。
原代培養離體時(shí)間短，遺傳性狀和體內細胞相似，適于做細胞形態(tài)、功能和分化等研究。嚴格地說(shuō)即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以?xún)鹊呐囵B細胞統稱(chēng)為原代細胞培養。一般持續1一4周。此期間細胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細胞分裂，但不旺盛。
細胞系
正常的哺乳動(dòng)物細胞具有下列四大生物學(xué)特性：
錨地依賴(lài)性：細胞必須負在固體上或固定的表面才能生長(cháng)分裂；
血清依賴(lài)性：細胞必須具有生長(cháng)因子才能正常生長(cháng)；
接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長(cháng)便受到抑制；
形態(tài)依賴(lài)性：細胞成扁平狀，并有長(cháng)纖維網(wǎng)狀結構；
上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細胞在體外培養中，一般只能存活50代且在培養皿上以平面的形式生長(cháng)，即單層細胞成長(cháng)。而正常細胞因某些特征的改變而越過(guò)生理臨界點(diǎn)，繼續增殖并無(wú)限制分裂，這種狀態(tài)稱(chēng)為細胞系形成，此時(shí)的細胞稱(chēng)為細胞系。
培養基
開(kāi)始工作前，請檢查細胞系隨附信息，以確定應使用的培養基類(lèi)型、添加劑和建議。
大多數細胞系可以使用 DMEM 培養基或含 10％ 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培養基進(jìn)行培養，并且可以根據需要添加 2 mM 谷氨酰胺和抗生素（見(jiàn)下表）。
使用 DMEM 培養基的一般示例：
| 培養基 | 標準量 |
| DMEM - 從 500 mL 瓶中取出 50 mL后，添加其它成分。 | 450 mL |
| 10% 胎牛血清（FBS） | 50 mL |
| 2 mM 谷氨酰胺 | 5 mL |
| 100 U 青霉素/0.1 mg/mL 鏈霉素 | 5 mL |
pH值
大多數正常的哺乳動(dòng)物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長(cháng)良好，而且不同細胞株間差異極小。
CO2
生長(cháng)培養基可控制培養物的pH值，為培養細胞pH值的變化提供緩沖作用。通常，這種緩沖作用通過(guò)添加有機（例如HEPES）緩沖液或者CO2-HCO3-（碳酸氫鹽）緩沖液實(shí)現。
培養基的pH值取決于溶解態(tài)CO2與HCO3-間的精密平衡，因此，空氣中CO2含量的變化會(huì )改變培養基的pH值。為此，使用含CO2-HCO3-緩沖液的培養基時(shí)必須使用外源性CO2，特別是使用開(kāi)放式培養皿培養細胞或者需要在高濃度條件下進(jìn)行細胞系培養時(shí)。雖然大多數研究人員通常使用的是空氣中CO2濃度為5-7%培養基，但是4-10%濃度的CO2適用于大多數細胞培養實(shí)驗。
溫度
細胞培養的最佳溫度主要取決于分離來(lái)源的細胞宿主的體溫，此外也部分受到解剖部位體溫差異的影響（例如皮膚溫度可能低于骨骼肌的溫度）。與溫度過(guò)低相比，細胞培養時(shí)溫度過(guò)高是更為嚴重的問(wèn)題；因此，往往將培養箱的溫度設定為略低于最佳溫度的溫度。
大多數人類(lèi)和哺乳動(dòng)物細胞系在36°C至37°C下具有最佳生長(cháng)狀態(tài)。
觀(guān)察細胞
每天用顯微鏡觀(guān)察細胞，以監測其健康狀況、生長(cháng)速度和融合度（被單層細胞覆蓋的表面積的百分比）。
貼壁細胞應主要附著(zhù)在培養瓶底部，呈貼壁形態(tài)（取決于細胞系）并在其膜周?chē)凵涑龉饩€(xiàn)懸浮細胞應呈圓形形態(tài)，并在其膜周?chē)凵涑龉饩€(xiàn)。一些懸浮細胞可能會(huì )結團（可添加 Pluronic PF68 等解離試劑去除結團）。
含酚紅的培養基應為粉紅色/橙色（培養基顏色可能會(huì )隨CO2環(huán)境發(fā)生變化）。成像時(shí)可使用不含酚紅的培養基，避免干擾圖像采集。培養基呈淡黃色表示其呈酸性且 pH 值降低，通常與受到污染或細胞不健康有關(guān)。
如果出現以下情況，請丟棄細胞：
細胞大量脫落（貼壁細胞系）和/或看起來(lái)干癟并呈顆粒狀/深色；
細胞處于靜止狀態(tài)（看起來(lái)根本沒(méi)有生長(cháng)）；
接種密度可用于確保細胞在某一特定日期適合某項實(shí)驗，或保留細胞培養物以備將來(lái)使用或作為備份。懸浮細胞系根據體積進(jìn)行接種，因此其接種密度以細胞數/mL 為計算單位，而貼壁細胞系則根據培養瓶表面積進(jìn)行接種，因此其接種密度以細胞數/cm2為計算單位。不同的細胞系通常需要滿(mǎn)足特定的接種密度，因此務(wù)必查看關(guān)于所用細胞系的指南。
貼壁細胞系分板時(shí)，可以使用特定的細胞系分板比或接種密度（細胞數/cm2）：
分板比為 1：2 時(shí)，融合度應達到 70-80％，并可在 1-2 天內進(jìn)行實(shí)驗；
分板比為 1：5 時(shí)，融合度應達到 70-80％，并可在 2-4 天內進(jìn)行實(shí)驗；
分板比為 1：10 時(shí)，融合度應達到 70-80％，并可在 4-6 天內進(jìn)行實(shí)驗；
分板比基于培養瓶表面積計算，例如：
分裂比為 1:3 時(shí)，1 x 25 cm2 培養瓶可以產(chǎn)出 3 x 25 cm2 培養瓶或 1 x 75 cm2
懸浮細胞系應使用特定的細胞系接種密度（細胞數/mL）進(jìn)行維持：
2e5 應在 3-4 天內進(jìn)行實(shí)驗；
1e6 應在 1-2 天內進(jìn)行實(shí)驗；
如果細胞長(cháng)時(shí)間無(wú)人看管（例如公共假日或周末），建議使用低于正常水平的接種密度/分板比。
更換培養基
如果細胞在幾天內生長(cháng)良好但尚未融合，則需更換培養基，以補充營(yíng)養并維持合適的 pH 值。細胞會(huì )產(chǎn)生促生長(cháng)因子，這些因子會(huì )被分泌到培養基中，因此更換一半培養基既能補充培養基提供的營(yíng)養也能保留這些促生長(cháng)因子。
傳代培養懸浮細胞系
查看細胞系指南推薦的細胞分板比或傳代培養細胞密度。
用移液管從培養瓶中將所需量的細胞懸液吸移至新培養瓶中。
例如：
要達到 1:2 的分裂比，需要從 100 mL 細胞懸液中吸出 50 mL。
要達到 1:5 的分裂比，需要從 100 mL 細胞懸液中吸出 20 mL。
將所需量的預熱細胞培養基加入到新培養瓶中。
傳代培養需要胰蛋白酶的貼壁細胞系
注意–并非所有細胞都需要胰蛋白酶化，因為胰蛋白酶化對某些細胞可能是有害的。胰蛋白酶還可能會(huì )誘使某些膜蛋白暫時(shí)內化，因此設計實(shí)驗時(shí)應考慮到這一點(diǎn)。在這些情況下，通?？奢p輕地刮除細胞或使用非常溫和的消化試劑或采用其他替代方法。
準備就緒后，小心地將裝有所需細胞的培養瓶中的培養基倒入廢液罐（盛有約 100 mL 10％ 次氯酸鈉），注意不要滴落，以免增加污染風(fēng)險。
利用無(wú)菌技術(shù)，將足量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）倒入/移液至培養瓶中，以洗滌細胞并完全除去殘留培養基中的胎牛血清（FBS）。輕輕搖動(dòng)幾次培養瓶，以沖洗細胞，然后小心地將無(wú)菌 PBS 倒回/移液至廢液罐中。
必要時(shí)可以重復一到兩次（某些細胞系進(jìn)行胰蛋白酶消化的時(shí)間較長(cháng)，并且需要多次沖洗才能徹底去除殘留的 FBS，從而促進(jìn)胰蛋白酶化）。
用移液管加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液，以覆蓋培養瓶底部的細胞。
例如：
在 25cm2 培養瓶中，加入約 1 mL 胰蛋白酶- EDTA溶液。
在 75 cm2 培養瓶中，加入約 5 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
在 175 cm2 培養瓶中，加入約 10 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
輕輕轉動(dòng)培養瓶，確保胰蛋白酶與所有細胞接觸。將培養瓶放入 37 ℃ 培養箱中。不同細胞系的胰蛋白酶化時(shí)間不同。為了避免因過(guò)度胰蛋白酶化而嚴重破壞細胞，必須每隔幾分鐘進(jìn)行一次檢查。
細胞脫離后（可能需要輕輕敲擊幾下培養瓶），立即向培養瓶中添加一些培養基（培養基中的 FBS 會(huì )使胰蛋白酶失活）
按照所需的分板比，用移液管從該細胞懸液中將所需體積的細胞吸移到新培養瓶中。然后向這些培養瓶中添加培養基至所需體積。
例如：
在 25cm2 培養瓶中，加入約 5-10 mL 培養基。
在 75 cm2 培養瓶中，加入約 10-30 mL 培養基。
在 175 cm2 培養瓶中，加入約 40-150 mL 培養基。
放置細胞過(guò)夜，使細胞恢復并重新貼壁。更換培養基，以徹底清除殘留的胰蛋白酶。
請始終用70%乙醇擦拭雙手和工作區；
將容器、培養瓶、培養板和培養皿放入細胞培養通風(fēng)櫥之前，先用70%乙醇擦其外部；
不要直接從試劑瓶或培養瓶中傾倒培養基和試劑；
使用無(wú)菌玻璃或一次性塑料移液管和移液器操作液體時(shí)，每只移液管只能使用一次，以避免交叉污染，無(wú)菌移液管到使用時(shí)才能打開(kāi)其包裝，移液管應存放在作區內；
試劑瓶和培養瓶使用后應蓋上蓋子，多孔板應用膠帶密封或放入可重復密封的袋中，以防止微生物和懸浮污染物進(jìn)入；
無(wú)菌培養瓶、試劑瓶和培養皿等到使用時(shí)才能打開(kāi)蓋子，不得將其開(kāi)放暴露在境中，使用后，應立即蓋好蓋子；
蓋子取下后，必須開(kāi)口朝下放置在工作臺面上；
必須使用無(wú)菌的玻璃器皿和其他設備；
進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，不要交談、唱歌或吹口哨；
盡可能快速地進(jìn)行實(shí)驗，以降低污染風(fēng)險；
