分子篩結果解讀

尺寸排阻色譜（SEC）也稱(chēng)為凝膠色譜，俗稱(chēng)分子篩。當洗脫液為水溶液或緩沖液時(shí)，稱(chēng)為凝膠過(guò)濾色譜（GFC），在生物學(xué)領(lǐng)域應用廣泛；當使用有機溶劑作為洗脫液時(shí)，稱(chēng)為凝膠滲透色譜（GPC），被廣泛用于高分子領(lǐng)域。尺寸排阻色譜通常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)和核酸。

尺寸排阻色譜基于蛋白質(zhì)分子量或分子形狀的差異對樣品進(jìn)行分離。當樣品從色譜柱頂部向下移動(dòng)時(shí)，大的蛋白質(zhì)分子無(wú)法進(jìn)入凝膠顆粒并被快速洗脫；而較小的蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠顆粒，并且較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠的保留時(shí)間不同。分子量越大，洗脫時(shí)間越早，從而使具有不同分子大小的蛋白質(zhì)被分離。

圖1.體積排阻色譜法原理（Wolf et al, 2015）

在蛋白分離純化中也常用到分子篩，主要有兩個(gè)作用，一是分離純化；二是蛋白分析，新手接觸的時(shí)候不知道怎么去分析分子篩結果，下面以不同的實(shí)例解讀一下些各自的區別。

在科研實(shí)驗中，蛋白純化第一步通常采用親和層析，但一步層析大部分情況下很難達到很高的純度，根據SDS-PAGE膠圖結果，可以選用分子篩來(lái)進(jìn)一步分離純化目的蛋白，需要注意的是分子篩規格的選擇，不同大小的蛋白選用的柱子規格可能有差異，需要結合分子篩柱的分辨率來(lái)選擇，不熟悉的話(huà)可以查詢(xún)柱子說(shuō)明書(shū)。

圖2.鎳柱純化結果

(泳道8、9為Elution結果)

圖3.泳道8/9過(guò)分子篩圖譜

圖4. 分子篩電泳結果

從結果可看出分子篩能有效分離雜蛋白與目的蛋白。但要注意的是，使用分子篩分離純化目的蛋白的時(shí)候分子量之間應該有較大差異（一倍以上分子量）才能有效分離。

分子篩的另一個(gè)作用是作為蛋白分析工具，多聚集態(tài)蛋白與單體蛋白分子量不一樣，復合物與單個(gè)亞基分子量也不一樣，分子篩可以利用這種有差異的分子量來(lái)分析、分離蛋白狀態(tài)。

圖5.蛋白分析結果

(泳道1為親和層析樣品，純度高，分子篩有兩個(gè)峰，主峰明顯，

可能是二聚體或者是多聚體，樣品均一性較好)

圖6.蛋白分析結果

親和層析純化后蛋白樣品純度高，分子篩分析出現兩個(gè)明顯峰尖，sds-pag膠檢測蛋白大小一致，可以看出蛋白純化后均一性不高，多聚態(tài)和單體混合存在，通過(guò)分子可以分離出不同狀態(tài)蛋白，后續可根據需要選用不用狀態(tài)蛋白開(kāi)展工作。