康體生命新產(chǎn)品-直標VHH抗體一步法Western Blot介紹
Western blotting，又稱(chēng)蛋白免疫印跡，是一種廣泛應用的分子生物學(xué)技術(shù)，主要用于檢測、分析和定量復雜生物樣本（如細胞裂解液、組織勻漿、血清、尿液等）中特定蛋白質(zhì)的存在、表達水平以及可能的修飾狀態(tài)。
01 基本原理
Western blot的核心原理是利用抗原-抗體特異性結合的原理，結合蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)和固相免疫檢測技術(shù)，實(shí)現對目標蛋白質(zhì)的定性、定量分析。傳統WB步驟分為電泳-轉膜-封閉-一抗孵育-洗一抗-二抗孵育-洗二抗-曝光八個(gè)實(shí)驗步驟，需要1-2天才能完成實(shí)驗流程，康體生命推出的直標標簽納米抗體（Anti-tag VHH-HRP）系列產(chǎn)品，只需一步抗體孵育，能有效減少實(shí)驗時(shí)間，最快半天可完成WB實(shí)驗，大大提高實(shí)驗效率。
適用場(chǎng)景：用Western Blot檢測帶有標簽（HA、MYC、FLAG、MBP、GST、Strep-Tag II，GFP，Mcherry）的融合蛋白。
適用產(chǎn)品：Anti-tag VHH-HRP、Anti-tag VHH-Biotin預混SA-HRP。
02 具體步驟
1. 蛋白提取與定量：首先從樣本中提取總蛋白質(zhì)，通常采用適當的裂解緩沖液破壞細胞結構并釋放蛋白質(zhì)，然后通過(guò)BCA法、Bradford法或Lowry法等進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。
2. 電泳分離：使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）依據蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量（MW）進(jìn)行分離，樣本中的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下按照大小分布于凝膠的不同位置。
?Tips：電泳時(shí)間大約1.5h內
3. 轉膜：電泳后的凝膠通過(guò)電轉移系統將分離好的蛋白質(zhì)轉移到一種疏水性的固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，形成“蛋白質(zhì)印跡”。
?Tips:轉膜時(shí)間約0.5h，根據蛋白大小、轉膜方式等調整時(shí)間
4. 封閉：為了減少非特異性結合，用含一定濃度的非離子型洗滌劑（如Tween-20）和蛋白質(zhì)（如BSA或脫脂奶粉）的緩沖液對膜進(jìn)行封閉。
?Tips：可用含5%脫脂奶的TBST/PBST封閉，或選擇商用封閉液，封閉時(shí)間2h，或者4℃過(guò)夜，延長(cháng)封閉時(shí)間可以減少背景
加入一抗（針對目標蛋白質(zhì)的特異性抗體）孵育，使一抗與膜上的目標蛋白結合。
5.抗體孵育：倒掉封閉液，加入稀釋好的VHH直標抗體，室溫孵育2h，回收抗體再利用，用TBST或PBST等buffer洗去未結合的一抗。
?Tips：抗體孵育時(shí)間1-2h，也可4℃過(guò)夜孵育，孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)的話(huà)可能導致非特異性結合，為了背景干凈，可曾加洗抗體次數
6. 信號檢測與分析：根據標記物類(lèi)型選擇相應的檢測方法。對于HRP酶標記，常用化學(xué)發(fā)光法（ECL）或染料顯色法（如DAB）；對于熒光標記，可直接進(jìn)行熒光成像。通過(guò)成像設備記錄并量化信號強度，對應到蛋白質(zhì)的位置（分子量），從而確定目的蛋白的存在及其相對含量。
?Tips:曝光時(shí)間可以多嘗試，發(fā)光弱后可以再次添加發(fā)光液重新曝光
二、應用領(lǐng)域
1. 基因功能研究：通過(guò)比較不同處理條件下（如野生型與突變型、藥物處理前后、正常與疾病狀態(tài)等）目標蛋白的表達變化，揭示基因調控機制或蛋白功能在特定生理或病理過(guò)程中的作用。
2. 疾病診斷與監測：檢測病患體液或組織中特定疾病標志蛋白的表達水平，如癌癥相關(guān)抗原、炎癥因子、自身免疫疾病的抗體等，輔助疾病診斷、預后評估或治療效果監測。
3. 藥物篩選與藥效評價(jià)：評估候選藥物對靶蛋白表達或活性的影響，作為藥物作用機制研究和藥效評價(jià)的重要手段。
4. 抗體驗證：確認抗體對目標蛋白的特異性和敏感性，用于優(yōu)化實(shí)驗條件、確保后續實(shí)驗結果的可靠性。
5. 蛋白修飾研究：通過(guò)使用特異性識別磷酸化、乙?；?、泛素化等修飾形式的抗體，檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀態(tài)的變化，探究其在細胞信號傳導、蛋白質(zhì)穩定性調控等方面的功能。
6. 蛋白質(zhì)純度鑒定：對純化得到的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，確認其純度及正確分子量，為后續的結構功能研究提供保證。
03 應用領(lǐng)域
1. 基因功能研究：通過(guò)比較不同處理條件下（如野生型與突變型、藥物處理前后、正常與疾病狀態(tài)等）目標蛋白的表達變化，揭示基因調控機制或蛋白功能在特定生理或病理過(guò)程中的作用。
2. 疾病診斷與監測：檢測病患體液或組織中特定疾病標志蛋白的表達水平，如癌癥相關(guān)抗原、炎癥因子、自身免疫疾病的抗體等，輔助疾病診斷、預后評估或治療效果監測。
3. 藥物篩選與藥效評價(jià)：評估候選藥物對靶蛋白表達或活性的影響，作為藥物作用機制研究和藥效評價(jià)的重要手段。
4. 抗體驗證：確認抗體對目標蛋白的特異性和敏感性，用于優(yōu)化實(shí)驗條件、確保后續實(shí)驗結果的可靠性。
5. 蛋白修飾研究：通過(guò)使用特異性識別磷酸化、乙?；?、泛素化等修飾形式的抗體，檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀態(tài)的變化，探究其在細胞信號傳導、蛋白質(zhì)穩定性調控等方面的功能。
6. 蛋白質(zhì)純度鑒定：對純化得到的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，確認其純度及正確分子量，為后續的結構功能研究提供保證。
綜上所述，Western blot作為一種成熟且靈活的技術(shù)平臺，在生物醫學(xué)研究、臨床診斷、藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應用價(jià)值，為深入理解蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的角色提供了關(guān)鍵信息，康體生命提供的直標標簽納米抗體能節約實(shí)驗時(shí)間，助力科研發(fā)展。
