原核表達包涵體復性實(shí)例
前言
包涵體在原核表達中非常常見(jiàn)，但是沒(méi)有一個(gè)通用的復性解決方案，常用的復性手段有稀釋復性、透析復性、分子篩及離子柱層析等，復性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，下面我們分享三個(gè)蛋白復性的實(shí)例。
先復性后純化
細菌破碎后離心收集沉淀，trisbuffer洗滌包涵體3-5次，跑膠檢測包涵體純度
用5-10ml 6M鹽酸胍（ph1.5）溶解包涵體，室溫攪拌30min-1h，離心去除不溶物；
將溶解后包涵體蛋白快速滴定到4℃預冷pbs中，緩慢攪拌，過(guò)夜復性，離心去除沉淀；
緩慢加（40%）硫酸銨，3h后離心去沉淀（未完全復性的蛋白）；加終濃度70%硫酸銨，4℃過(guò)夜孵育，離心取沉淀，溶解到5-10ml pbs中即為目的蛋白。
復性結果如下圖所示
圖1.包涵體檢測
泳道1：鹽酸胍溶解包涵體 泳道2：包涵體洗滌后
圖2.蛋白復性后檢測
1.破胞后洗滌沉淀，沉淀用變性劑buffer（8M脲）室溫溶解3h后高速離心去除沉淀，上清中加入Ni填料，4℃混勻孵育2h；
2.孵育結束后轉移beads至層析柱，依次用不同濃度咪唑Wash buffer沖洗柱子；
3.Elute buffer洗脫蛋白后跑膠檢測純度；
4.包涵體復性：變性蛋白測濃度后滴定入復性buffer（ 100 mM Tris–HCl, 0.5M 甘氨酸, 1 mM氧化型谷胱甘肽,10 mM 還原型谷胱甘肽, pH8.0） ，使蛋白終濃度為0.1mg/ml， 緩慢攪拌，4℃復性反應過(guò)夜，離心去除沉淀，上清轉移到透析袋，pbs透析4h，換液至少2次，濃縮后過(guò)分子篩。
復性結果如下圖所示
圖3.包涵體純化結果
泳道1為包涵體溶解后上清，泳道2為包涵體溶解后沉淀，泳道3為20mM洗雜，泳道4為40mM洗雜，
泳道5為60mM洗雜，泳道6為100mM洗雜，泳道7為300mM洗脫，泳道8、9為500mM洗脫
圖4.復性后檢測結果
柱上復性
層析柱上復性與普通親和層析操作類(lèi)似，只是在細胞破碎時(shí)候用變性buffer（如8M脲），離心后上清蛋白溶液正常上層析柱，洗雜過(guò)程中依次降低變性劑含量，如8M-6M-4M-2M-1M-0.5M-0，使蛋白在層析柱上復性，最后用不含變性劑的咪唑buffer洗脫，即可得到復性后蛋白，實(shí)例圖如下：
圖5.親和層析結果
泳道1為誘導前，泳道2為誘導后，泳道3為破碎后沉淀（變性劑破碎），泳道4為破碎后上清（變性劑破碎），
泳道5為，泳道6為6M尿素洗雜，泳道7為4M尿素洗雜，泳道8為2M尿素洗雜，泳道9為1 M尿素洗雜，
泳道10為0.5M尿素洗雜，泳道11為0M尿素復性洗雜，泳道12為300mM咪唑洗脫，泳道13、14為500mM咪唑洗脫。
復性洗脫后根據實(shí)驗需求再進(jìn)一步純化即可。
小結
包涵體形成原因較多，方法也就不一而論，需要各種嘗試才能找到一個(gè)合適的方法，需要一點(diǎn)運氣，更需要的是對科研的探索精神。
