重組蛋白表達常見(jiàn)異常及解決方案

選擇合適的技術(shù)路線(xiàn)會(huì )讓整個(gè)實(shí)驗過(guò)程事半功倍，少走彎路，一般來(lái)說(shuō)要遵循幾個(gè)基本的原則：最根本的一點(diǎn)是要能滿(mǎn)足實(shí)驗需求，例如研究一個(gè)人源蛋白，對其活性或者翻譯后修飾要求很高，那就首選哺乳動(dòng)物表達系統，或者只需要簡(jiǎn)單 Western Blot 驗證，那大腸表達就能滿(mǎn)足需求；二是經(jīng)濟性及時(shí)效性，一般來(lái)說(shuō)大腸表達最快、成本也最低，哺乳動(dòng)物表達成本較高，時(shí)間也較長(cháng)；三是技術(shù)熟練度及其他需要考慮的問(wèn)題。

一、設計問(wèn)題

設計問(wèn)題常出現在新手中，常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題如信號肽未去除、密碼子位移等。成熟蛋白一般是不帶信號肽的，大腸桿菌本身也缺乏處理信號肽的機制，信號肽本身一般也具有較強的疏水性，帶信號肽表達會(huì )導致蛋白無(wú)活性或大量包涵體等問(wèn)題，所以一般在原核表達時(shí)候會(huì )去除信號肽；密碼子移碼主要容易在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)候出現，比如常見(jiàn)的 Nco I 位點(diǎn)。另外比如稀有密碼子可通密碼子優(yōu)化解決，在蛋白不表達的時(shí)候可以嘗試優(yōu)化一下密碼子；序列 GC 含量、蛋白大小等問(wèn)題都是在設計時(shí)候需要考慮到的問(wèn)題；純化標簽的選擇，促溶標簽對后續研究是否有干擾等也需要全面考慮。

二、表達及純化過(guò)程中遇到的問(wèn)題

1、蛋白不表達

蛋白不表達原因很多，大部分情況下可以從下面的幾個(gè)方面去調整排除。通常來(lái)說(shuō)原核表達中小于 10kd、大于 100kd 的蛋白是比較難表達的；質(zhì)粒構建好后一定要通過(guò)測序確認，仔細比對載體序列及插入序列，確保沒(méi)有移碼及突變；檢查表達菌株與質(zhì)粒是否配套，比如Novagen 的 pet 系列載體是 T7 啟動(dòng)子，配套常用 BL21 及其衍生菌株，Qiagen 的 pQE 系列載體使用的是 T5 啟動(dòng)子，需要用到 M15 等配套菌株做表達；檢查表達條件是否合適，比如誘導型表達是用誘導劑還是溫度誘導，是否是組成型表達等；培養基的選擇，LB 培養基中不表達，換用富營(yíng)養的 TB 培養基可能會(huì )解決這個(gè)問(wèn)題；也有可能是蛋白表達量太低或者是降解快，必要時(shí)需要通過(guò) Western Blot 來(lái)確認。

2、純化中常見(jiàn)問(wèn)題

2.1 包涵體及其復性 

包涵體在原核中及其常見(jiàn)，通常來(lái)說(shuō)是因為蛋白不正確折疊形成的，原因很多，可能表達過(guò)快而來(lái)不及折疊，也可能是缺少翻譯后修飾導致不正確折疊，還可能是蛋白本身疏水性強等各種原因，可以通過(guò)降低誘導溫度及誘導劑濃度、引入分子伴侶共表達、換專(zhuān)用感受態(tài)等方式來(lái)解決，或者包涵體純化后復性，注意包涵體純化復性一般是 his 標簽蛋白，常用變性劑為尿素和鹽酸胍，其他純化標簽需要注意是否兼容變性劑。包涵體純化后的復性是一個(gè)世界性難題，并沒(méi)有一個(gè)通用解決方案，常用的復性手段有稀釋復性、透析復性、分子篩及離子柱層析等，復性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，添加劑如 PEG8000、精氨酸等在復性中也常用到，可在一定程度上提高復性成功率。

   包涵體
 1：誘導前 ，2：誘導后，3：包涵體，4：上清

2.2 蛋白降解 

降解也是純化中常見(jiàn)的現象，一般是因為細菌本身的蛋白酶引起的，在破胞及后續的操作中保持低溫及全程添加蛋白酶抑制劑能一定程度上解決降解問(wèn)題；buffer 中加 5-10%甘油也能起到抑制降解的作用；檢查蛋白序列，可參考 pET 手冊中的 N 端原則，如果 M 后為精氨酸 、賴(lài)氨酸、 組氨酸 、苯丙氨酸 、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸或色氨酸等的話(huà)可能對蛋白穩定性影響較大，盡量避免；也可能是表達提前終止，或者因為密碼子偏好性問(wèn)題，可換用其他感受態(tài)如 Rosett、OrigamiB 等嘗試；如果真核蛋白翻譯后修飾對蛋白穩定性有影響的話(huà)需要考慮換用真核表達。

2.3 蛋白純度不高 

純化過(guò)程中洗雜并不是每次都能很完美洗去雜蛋白，特別是Ni 柱純化的蛋白，通常雜蛋白較多，需要多種純化方式聯(lián)用，比如離子交換、疏水作用純化、分子篩等。原核表達純化蛋白時(shí)候很多時(shí)候分子伴侶會(huì )跟目的蛋白一起很難分離，可通過(guò)離子柱來(lái)結合分子伴侶蛋白而讓目的蛋白直接流過(guò)柱子來(lái)分離，也可嘗試 Ni 親和層析時(shí)候用高鹽 buffer（eg：2M NaCl），很多時(shí)候也能達到目的；也可更換表達感受態(tài)，降低表達背景，如 plysS 菌株；標簽聯(lián)用也能有效提高純化純度，并且很大程度上可以減少工作量，例如先用 his 標簽親和層析，再用 flag 標簽做二次純化，因 flag 特異性很強，二次純化能明顯提高蛋白純度，但因其成本較高，flag 等標簽在大規模純化中不常用。

2.4 SDS-PAGE 條帶與預測大小不符

由于蛋白表達后存在多種狀態(tài)，電荷分布可能有差異，導致遷移速率有變化，會(huì )導致 SDS-PAGE 條帶偏移，復性后蛋白與變性蛋白比較容易出現大小偏移現象，不同的翻譯后修飾也會(huì )導致條帶大小不一樣，比如 Tau 蛋白存在多種異構體，同時(shí)具有較為復雜的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻譯后修飾，所以可能會(huì )出現多條條帶現像（eg：30-80 kDa），原核表達的 tau 與磷酸化 tau蛋白大小就有明顯差異，必要時(shí)候可通過(guò) WB 驗證。

以上只討論了體外表達中所遇到的一小部分問(wèn)題，研究過(guò)程中遇到問(wèn)題時(shí)需要大量排查、試錯工作，特別是在面對一個(gè)全新蛋白的時(shí)候，細心才是成功的關(guān)鍵。