NC|趙永娟教授等發(fā)現構象特異性納米抗體——靶向煙酰胺單核苷酸激活狀態(tài)SARM1

摘要
2022年12月9日，香港中文大學(xué)（深圳）醫學(xué)院趙永娟團隊及其合作者在Nature Communications（自然-通訊）雜志發(fā)表題為A conformation-specific nanobody targeting the nicotinamide mononucleotide-activated state of SARM1（一種靶向 SARM1 煙酰胺單核苷酸激活狀態(tài)的構象特異性納米體）的研究論文。研究人員利用康體生命抗體發(fā)現平臺，用SARM1蛋白免疫羊駝并建立噬菌體庫，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出能夠與SARM1激活狀態(tài)構象特異結合的納米抗體Nb-C6。SARM1的激活可導致細胞鈣離子水平升高，與多途徑誘導的周?chē)窠?jīng)病變有關(guān)。了解 SARM1的激活機制具有重要意義，Nb-C6能夠特異結合并穩定激活狀態(tài)的SARM1，Nb-C6幫助研究者探究了SARM1在激活過(guò)程中的結構變化，并可以對細胞中的活性 SARM1 進(jìn)行成像和定位，提供了在活細胞中操縱 SARM1 的方法。

前言

正文
研究人員為了了解 SARM1激活狀態(tài)的結構，采取了利用納米抗體(Nb)穩定SARM1活性形式結構的方法。研究人員用重組的SARM1與弗氏佐劑混合免疫羊駝。經(jīng)過(guò)6輪免疫后，從外周淋巴細胞提取mRNA，并在此基礎上構建了納米抗體文庫（圖1），利用噬菌體展示技術(shù)篩選到了多條能與SARM1結合的陽(yáng)性克隆。其中，Nb-C6能夠特異識別 NMN 激活的 SARM1。 

圖1 Nb-C6的研發(fā)流程

研究人員用表面等離子體共振（SPR）技術(shù)測試了在不同濃度配體溶液中Nb-C6與SARM1的結合情況，在高 NAD 濃度（1.6 mM）下，Nb-C6 與 SARM1 的結合非常低。隨著(zhù)配體濃度轉變至100 μM NMN，Nb-C6與 SARM1的結合比例增加到了60%以上，其線(xiàn)性擬合圖和結合示意圖如圖2所示，表明 NAD / NMN 比率決定了 Nb - C6與SARM1的結合，Nb-C6能夠特異結合NMN激活狀態(tài)下的SARM1。

                                                                                                                  圖2 Nb-C6指示并促進(jìn)SARM1的激活

研究人員進(jìn)一步測試了與mNeonGreen (mNG，一種熒光標記蛋白)融合表達的Nb-C6可視化檢測細胞中激活形式的SARM1的能力。表達了SARM1 的HEK 293 細胞用CZ-48（能夠穿透細胞膜的NMN類(lèi)似物）處理，成像結果表明，Nb-C6的結合在 CZ-48 激活 SARM1 后顯著(zhù)增加，證實(shí)了其構象特異性并表明線(xiàn)粒體定位的 SARM1 的激活經(jīng)歷了構象變化。此外，作者還發(fā)現Nb-C6單獨在體外可以激活SARM1，但與NMN和兩者一起激活相比效果明顯較弱。他們還證明，在內源表達和誘導表達SARM1的兩種HEK 293細胞中過(guò)度表達Nb-C6（C6-YFP）導致cADPR水平升高，表明內源性和誘導性SARM1分別被激活。在過(guò)度表達不相關(guān)Nb的對照細胞中沒(méi)有觀(guān)察到cADPR的增加。上述結果充分驗證了 Nb-C6 僅識別 SARM1 的激活形式，最低限度地識別非活性形式，表明 Nb-C6 是激活活細胞內源性和外源性 SARM1 的有價(jià)值的工具。

圖3 (a) Nb-C6 對 CZ-48 激活的 SARM1 進(jìn)行染色，表達SARM1的 HEK293 細胞用 1 μg/mL 多西環(huán)素處理 12 小時(shí)，然后用 100 μM CZ-48 處理 6 小時(shí)，固定細胞并分別用 C6-mNeonGreen、抗 SARM1多克隆抗體、線(xiàn)粒體染料Tom20染色。水平比例尺：5 μm；（b）Nb-C6 染色和抗 SARM1 染色信號的比率。

為深入了解SARM1的激活機制，研究人員通過(guò)冷凍電子顯微鏡獲得了SARM1NMN/Nb-C6 復合物的結構（分別率：2.7 ?），復合物含兩層八聚環(huán)，包含16個(gè)SARM1和16個(gè)Nb-C6。Nb-C6 主要與 SAM 結構域結合并在 C 末端二聚化，穩定整個(gè)結構。SARM1NMN 的整體結構呈“盛開(kāi)的蓮花”形狀（圖 3a-c），與 SARM1NAD 緊湊的“甜甜圈”結構（圖4）形成鮮明對比。 相較于SARM1NAD， ARM-TIR 域作為一個(gè)整體從 SAM 域擺動(dòng)并旋轉~139°。NMN 結合暴露區域后，SARM1 的這種大構象變化被 Nb-C6 識別，說(shuō)明其僅對 NMN 激活的 SARM1 具有特異性。

圖4活化和非活化狀態(tài)下 SARM1 的冷凍電鏡結構。a–c SARM1NMN/Nb-C6 復合物的結構，（a）頂視圖； (b) 底視圖；(c) 側視圖; SARM1 和 Nb-C6 顯示為表面模型，ARM 域為綠色，TIR 域為品紅色，SAM 域為黃色，Nb-C6 為灰色，NMN 顯示為紅色球體。d-f SARM1NAD (PDB 7ANW) 的整體結構。 （d） 頂視圖； （e） 底視圖； （f） 側視圖；SARM1 顯示為表面模型，ARM 域為藍色，TIR 域為小麥色，SAM 域為黃色，NAD 顯示為紅色的球體模型。(g) NMN 和 NAD 結合的 SARM1 疊加的側視圖。為清楚起見(jiàn)，只有一個(gè) NMN 結合和 NAD 結合形式的SARM1顯示為卡通模型，其他結構被淡化，SARM1NMN 復合物中的 Nb-C6 被隱藏。SARM1NMN 的顏色與圖(a–c) 中一樣，SARM1NAD 的顏色與圖 (d–f) 中一樣；ARM 域中的殘基 E60 和 Q81 以及 TIR 域中的 E686 顯示為球體；相應殘基的重新定向由黑色箭頭指示。

研究人員通過(guò)分析結構數據，深入的解析了NMN誘導的SARM1激活機制，發(fā)現NMN 結合位點(diǎn)與 NAD 的結合位點(diǎn)相同，并通過(guò)ARMNMN 和 ARMNAD 之間的結構差異解釋了為何NMN 是激活劑而 NAD 是抑制劑。NMN/NAD 結合位點(diǎn)處的突變可以消除神經(jīng)元中SARM1對煙酰胺核糖誘導的NMN 積累的反應。作者還發(fā)現ARM 域的向內彎曲對于 NMN 誘導的 SARM1 激活是必要的。接下來(lái)，作者研究了 NMN 誘導的 ARM 彎曲如何導致其從 SAM 域解離，并發(fā)現納米抗體主要與 SAM 域結合，較小程度上與 ARM-SAM 連接子結合。Nb-C6 和 SAM 域之間的結合界面在很大程度上與ARM:SAM 界面重疊（圖 5），這說(shuō)明 Nb-C6 無(wú)法識別非活性 SARM1，因為結合位點(diǎn)被 ARM 遮蓋了。

HDX-MS （氫氘交換質(zhì)譜）和 XL-MS（交聯(lián)質(zhì)譜） 數據表明 NMN 激活的 SARM1 在溶液中經(jīng)歷了一系列 ARM 和 TIR 結構域重排。因此，Nb-C6 穩定結構可能代表這種最終激活狀態(tài)的中間體。如圖 6 所示，在這個(gè)最終狀態(tài)下，TIR 域從 ARM 脫離并直接與相鄰的 TIR 相互作用，形成多聚體并導致酶促活動(dòng)。這種構象變化與 ARM 結構域重排相結合，有助于 SARM1 外圍環(huán)的分解。

                                                                                     圖6 SARM1在非激活和激活狀態(tài)間的轉換模型

小結
SARM1 因其在軸突退變（AxD）中的作用而受到關(guān)注。SARM1 是 NADase 和自我調節信號酶，可生成 cADPR 和 NAADP。SARM1 的激活是由細胞內 NAD 的減少引起的，可在諸如紫杉醇誘導的周?chē)窠?jīng)病變情況下發(fā)生； NMN也可激活 SARM1。研究人員發(fā)現了一種構象特異性納米抗體Nb-C6，通過(guò)多種實(shí)驗證明了Nb-C6僅穩定并結合激活狀態(tài)的 SARM1，并利用Nb-C6實(shí)現了活細胞中激活狀態(tài)的SARM1的成像與定位。Nb-C6幫助作者獲得了SARM1在激活狀態(tài)的冷凍電鏡結構，聯(lián)合HDX-MS 和 XL-MS 方法，深入解析了SARM1的激活機制。納米抗體相較于傳統抗體有更優(yōu)秀的理化性質(zhì)，在生物學(xué)和醫學(xué)領(lǐng)域有諸多應用。 康體生命提供一站式納米抗體發(fā)現服務(wù)，歡迎咨詢(xún)與交流！